Resumo:
Pesquisadores desenvolveram um método para analisar vesículas extracelulares (EVs) no sangue como uma potencial ferramenta de detecção precoce para a doença de Parkinson (DP). Ao isolar EVs e examinar seus conteúdos, eles identificaram níveis elevados de α-sinucleína fosforilada em pacientes com DP. Se bem-sucedida, essa abordagem pode permitir métodos de diagnóstico não invasivos baseados no sangue para DP e outras doenças neurodegenerativas.
Um novo estudo conduzido por pesquisadores da Universidade de Harvard desenvolveu um método inovador para medir, com maior precisão, proteínas específicas em vesículas extracelulares (EVs) presentes no plasma, com foco na α-sinucleína, uma proteína ligada a doenças neurodegenerativas.
As EVs são partículas microscópicas que todas as células liberam e que transportam diversos materiais, incluindo proteínas, dentro de suas membranas.
Devido ao potencial das EVs como biomarcadores para doenças como o Parkinson, a análise de proteínas específicas contidas nessas vesículas tem sido um foco crescente na pesquisa biomédica.
No entanto, a quantidade reduzida de EVs no sangue e as dificuldades em separá-las de proteínas livres no plasma dificultam a avaliação precisa do conteúdo dessas vesículas.
O objetivo do estudo foi desenvolver e validar métodos confiáveis que confirmem se proteínas como a α-sinucleína estão realmente encapsuladas dentro das EVs, além de quantificar a quantidade relativa dessas proteínas dentro das EVs em comparação com o plasma total.
A α-sinucleína, em sua forma fosforilada (p-α-sinucleína), tem sido associada ao desenvolvimento de doenças como o Parkinson e a demência por corpos de Lewy, onde essa variante da proteína é conhecida por se acumular de maneira anormal.
Para superar os desafios de isolamento e medição de proteínas dentro de EVs, a equipe de Harvard usou uma abordagem integrada com várias tecnologias avançadas.
A Cromatografia de Exclusão de Tamanho (SEC) foi uma das técnicas, este método foi otimizado para isolar EVs de forma eficiente, separando-as com base em seu tamanho. A SEC possibilita um isolamento mais puro das EVs e reduz a contaminação com proteínas livres no plasma, um passo crítico para obter resultados confiáveis.
Alem disso, o ensaio de Proteção de Protease utiliza uma protease para degradar proteínas que estão fora das EVs. Como a membrana lipídica das EVs protege seu conteúdo interno, a α-sinucleína contida dentro delas permanece intacta, enquanto as proteínas livres no plasma são quebradas.
Esse método permite verificar se a α-sinucleína está realmente encapsulada dentro das EVs ou apenas presente no plasma como proteína livre.
Por fim utilizaram ELISAs Digitais com Arranjo de Moléculas Únicas (Simoa). Esta técnica de última geração é conhecida por sua capacidade ultrassensível de detectar proteínas em níveis mínimos.
Os ELISAs digitais Simoa foram empregados para medir os níveis de α-sinucleína total e α-sinucleína fosforilada dentro das EVs. Essa sensibilidade é essencial para analisar proteínas em concentrações muito baixas, comuns nas EVs.
A análise dos dados revelou informações cruciais sobre a α-sinucleína nas EVs. Foi confirmado que apenas uma pequena fração da α-sinucleína total no plasma está efetivamente presente dentro das EVs. Isso corrobora a ideia de que as EVs carregam a proteína em quantidades detectáveis, embora em pequena proporção.
Os pesquisadores observaram que a razão entre α-sinucleína fosforilada (p-α-sinucleína) e α-sinucleína total era mais alta dentro das EVs do que fora. Essa forma fosforilada da proteína é particularmente relevante, pois se associa à patologia de doenças neurodegenerativas.
A presença enriquecida de p-α-sinucleína dentro das EVs sugere que estas vesículas podem estar seletivamente carregadas com essa variante da proteína, o que pode ser um indicador importante de processos relacionados ao desenvolvimento da doença.
Estendendo sua análise, os pesquisadores aplicaram o método a amostras de plasma de pacientes com Parkinson e demência por corpos de Lewy.
Ao medir os níveis de α-sinucleína total e fosforilada nessas amostras, a equipe demonstrou que seu protocolo é eficaz para detectar proteínas associadas a EVs em pacientes, o que pode abrir portas para o uso dessas técnicas como ferramentas de diagnóstico. Isso é especialmente relevante para condições neurodegenerativas, onde a α-sinucleína desempenha um papel fundamental.
Este estudo proporciona uma nova abordagem para avaliar proteínas dentro das EVs, permitindo aos cientistas distinguir entre proteínas encapsuladas e proteínas livres no plasma.
Com esse avanço, torna-se possível usar EVs como biomarcadores para doenças neurodegenerativas, o que poderia ter um grande impacto na detecção precoce e no monitoramento dessas condições.
Futuras pesquisas deverão focar no refinamento desses métodos, bem como na ampliação para outros grupos de pacientes e na exploração de proteínas adicionais contidas nas EVs que possam estar ligadas a outros transtornos.
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Measurement of α-synuclein as protein cargo in plasma extracellular vesicles
Tal Gilboa, Dmitry Ter-Ovanesyan, Shih-Chin Wang, and David R. Walt
PNAS. October 30, 2024. 121 (45) e2408949121
Abstract:
Extracellular vesicles (EVs) are released by all cells and hold great promise as a class of biomarkers. This promise has led to increased interest in measuring EV proteins from both total EVs as well as brain-derived EVs in plasma. However, measuring cargo proteins in EVs has been challenging because EVs are present at low levels, and EV isolation methods are imperfect at separating EVs from free proteins. Thus, knowing whether a protein measured after EV isolation is truly inside EVs is difficult. In this study, we developed methods to measure whether a protein is inside EVs and quantify the ratio of a protein in EVs relative to total plasma. To achieve this, we combined a high-yield size-exclusion chromatography protocol with an optimized protease protection assay and Single Molecule Array (Simoa) digital enzyme-linked immunoassays (ELISAs) for ultrasensitive measurement of proteins inside EVs. We applied these methods to analyze α-synuclein and confirmed that a small fraction of the total plasma α-synuclein is inside EVs. Additionally, we developed a highly sensitive Simoa assay for phosphorylated α-synuclein (phosphorylated at the Ser129 residue). We found enrichment in the phosphorylated α-synuclein to total α-synuclein ratio inside EVs relative to outside EVs. Finally, we applied the methods we developed to measure total and phosphorylated α-synuclein inside EVs from Parkinson’s disease and Lewy body dementia patient samples. This work provides a framework for determining the levels of proteins in EVs and represents an important step in the development of EV diagnostics for diseases of the brain, as well as other organs.
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