Resumo:
Pesquisadores desenvolveram um dispositivo inovador capaz de diagnosticar glioblastoma, um câncer cerebral agressivo, em menos de uma hora. Utilizando um biochip inserido em uma pequena amostra de sangue, o dispositivo detecta receptores do fator de crescimento epidérmico (EGFRs) em vesículas extracelulares, aproveitando tecnologia eletrocinética. Este método oferece alta sensibilidade e precisão, reduzindo interferências e melhorando a detecção precoce. A tecnologia também pode ser adaptada para o diagnóstico de outras doenças, ampliando seu impacto na medicina.
Glioblastoma é o tipo mais comum e agressivo de tumor cerebral maligno que afeta adultos. Originado nas células da glia, responsáveis por apoiar e nutrir os neurônios, o glioblastoma cresce rapidamente e invade o tecido cerebral próximo, tornando-o especialmente difícil de tratar.
A incidência global é de aproximadamente 3 a 4 casos por 100.000 pessoas por ano, e ele é mais comum em homens e em pessoas acima de 50 anos.
Os sintomas incluem dores de cabeça persistentes, convulsões, náuseas, perda de memória, alterações na visão e dificuldades cognitivas ou motoras, dependendo da localização do tumor no cérebro.
O diagnóstico é geralmente feito por meio de exames de imagem, como ressonância magnética (RM) ou tomografia computadorizada (TC), além de biópsias para análise histológica.
Os tratamentos incluem cirurgia para remover o máximo possível do tumor, seguida de radioterapia e quimioterapia com temozolomida. Apesar do tratamento agressivo, o prognóstico é geralmente pobre, com uma média de sobrevivência de 12 a 15 meses após o diagnóstico, embora novos avanços, como imunoterapia e terapias-alvo, estejam sendo explorados para melhorar os resultados, um diagnostico precoce é a base de um melhor prognostico.
A biópsia líquida é uma técnica inovadora que oferece uma forma não invasiva de diagnosticar câncer através da detecção de biomarcadores presentes no sangue ou em outros fluidos corporais. Em vez de realizar uma biópsia tradicional, que envolve a remoção de tecido diretamente do tumor, a biópsia líquida procura por pequenas partículas, como vesículas extracelulares (EVs), exossomos ou até fragmentos de DNA e RNA que o tumor libera no corpo.
As EVs são partículas minúsculas liberadas por células, incluindo células cancerígenas, e carregam dentro delas materiais como proteínas e ácidos nucleicos (RNA e DNA), que podem fornecer informações valiosas sobre o tipo e o estágio do câncer.
Essas vesículas são particularmente interessantes porque protegem essas moléculas sensíveis, como o RNA, que de outra forma poderiam ser degradadas rapidamente no corpo. Por serem excretadas em grande quantidade e apresentarem alta estabilidade, as EVs são vistas como um excelente alvo para diagnósticos de câncer.
Pesquisadores identificaram que, em tumores como o glioblastoma, as células liberam EVs com uma carga molecular específica, como o Receptor do Fator de Crescimento Epidérmico (EGFR), que pode ser detectada através de exames especializados.
Um estudo recente publicado pelos pesquisadores da University of Notre Dame na revista Nature, eles focaram em um desses aspectos – o epítopo (uma parte da proteína) específico no Receptor do Fator de Crescimento Epidérmico (EGFR), que se torna mais acessível em células cancerosas devido a alterações moleculares.
Esse epítopo está presente tanto nas células tumorais quanto nas vesículas extracelulares que elas liberam, permitindo a detecção do câncer por meio de um simples exame de sangue. Eles analisaram 20 amostras de pacientes com glioblastoma e 10 pessoas sem a doença.
O ponto crucial do diagnóstico é um biochip que usa tecnologia eletrocinética para detectar biomarcadores, ou receptores ativos do fator de crescimento epidérmico (EGFRs), que são superexpressos em certos tipos de câncer, como glioblastoma, e encontrados em vesículas extracelulares.
O desafio para os pesquisadores era duplo: desenvolver um processo que pudesse distinguir entre EGFRs ativos e não ativos e criar uma tecnologia de diagnóstico que fosse sensível, mas seletiva na detecção de EGFRs ativos em vesículas extracelulares de amostras de sangue.
“Vesículas extracelulares ou exossomos são nanopartículas únicas secretadas por células. Elas são grandes — 10 a 50 vezes maiores que uma molécula — e têm uma carga fraca. Nossa tecnologia foi projetada especificamente para essas nanopartículas, usando suas características a nosso favor”, disse Hsueh-Chia Chang, professor de Engenharia Química e Biomolecular da Bayer em Notre Dame e autor principal do estudo.
Para fazer isso, os pesquisadores criaram um biochip que usa um sensor eletrocinético barato do tamanho de uma bola em uma caneta esferográfica. Devido ao tamanho das vesículas extracelulares, os anticorpos no sensor podem formar várias ligações com a mesma vesícula extracelular. Este método aumenta significativamente a sensibilidade e a seletividade do diagnóstico.
Então, as nanopartículas de sílica sintética "relatam" a presença de EGFRs ativos nas vesículas extracelulares capturadas, ao mesmo tempo em que trazem uma alta carga negativa. Quando vesículas extracelulares com EGFRs ativos estão presentes, uma mudança de voltagem pode ser vista, indicando a presença de glioblastoma no paciente.
Esta estratégia de detecção de carga minimiza a interferência comum em tecnologias de sensores atuais que usam reações eletroquímicas ou fluorescência.
O método de detecção utiliza potencial zeta altamente negativo de repórteres de sílica para produzir um sinal. a) Esquema geral e fluxo de trabalho geral da plataforma. Primeiro, amostras contendo EVs são incubadas, lavadas, incubadas com repórteres de sílica e lavadas novamente. A plataforma consiste em uma membrana de troca aniônica que permite apenas a passagem de contra-íons e exibe três regimes distintos na resposta corrente-voltagem. b) Resposta corrente-voltagem de uma membrana de troca aniônica: EV não produz nenhuma mudança na região de superlimitação, enquanto repórteres de sílica produzem uma mudança após formar um sanduíche devido à sua carga altamente negativa. c) Algoritmo de automação da plataforma com uma interface de automação, protótipo e biochip mostrando o alojamento do AEM. d) Desvio de voltagem para captura anti-CD63 e repórter anti-CD63 (ambos monoclonais e do mesmo clone) que têm como alvo um epítopo específico de CD63 – ligando-se apenas a espécies que contêm pelo menos duas cópias únicas de CD63 em diferentes concentrações de sEVs medidos em triplicatas. e) Potencial zeta altamente negativo de partículas de sílica em comparação com EVs de duas culturas de células e plasma saudável reunido (tudo feito em triplicatas, exceto sílica, onde há nove réplicas).
“Nosso sensor eletrocinético nos permite fazer coisas que outros diagnósticos não conseguem”, disse Satyajyoti Senapati, professor associado de pesquisa em engenharia química e biomolecular em Notre Dame e coautor do estudo.
Para o exame o sangue é colocado diretamente sem nenhum pré-tratamento para isolar as vesículas extracelulares. Isso se dá porque esse sensor não é afetado por outras partículas ou moléculas. Ele mostra baixo ruído e o torna mais sensível para detecção de doenças do que outras tecnologias.
No total, o dispositivo inclui três partes: uma interface de automação, um protótipo de uma máquina portátil que administra materiais para executar o teste e o biochip. Cada teste requer um novo biochip, mas a interface de automação e o protótipo são reutilizáveis.
A execução de um teste leva menos de uma hora, exigindo apenas 100 microlitros de sangue. Cada biochip custa menos de US$ 2 em materiais para fabricar.
Embora este dispositivo de diagnóstico tenha sido desenvolvido para glioblastoma, os pesquisadores dizem que ele pode ser adaptado para outros tipos de nanopartículas biológicas. Isso abre a possibilidade para a tecnologia detectar uma série de biomarcadores diferentes para outras doenças.
Alem disso, a plataforma de diagnóstico atual pode ser ampliada para testes em grandes bibliotecas de plasma não tratado de uma grande coorte de pacientes com câncer para estabelecer perfis específicos para diferentes tipos de câncer em diferentes estágios. Oferecendo uma nova esperança para diagnósticos mais precoces e precisos.
LEIA MAIS:
An anion exchange membrane sensor detects EGFR and its activity state in plasma CD63 extracellular vesicles from patients with glioblastoma.
Maniya NH, Kumar S, Franklin JL. et al.
Commun Biol 7, 677 (2024). https://doi.org/10.1038/s42003-024-06385-1
Abstract:
We present a quantitative sandwich immunoassay for CD63 Extracellular Vesicles (EVs) and a constituent surface cargo, EGFR and its activity state, that provides a sensitive, selective, fluorophore-free and rapid alternative to current EV-based diagnostic methods. Our sensing design utilizes a charge-gating strategy, with a hydrophilic anion exchange membrane functionalized with capture antibodies and a charged silica nanoparticle reporter functionalized with detection antibodies. With sensitivity and robustness enhancement by the ion-depletion action of the membrane, this hydrophilic design with charged reporters minimizes interference from dispersed proteins, thus enabling direct plasma analysis without the need for EV isolation or sensor blocking. With a LOD of 30 EVs/μL and a high relative sensitivity of 0.01% for targeted proteomic subfractions, our assay enables accurate quantification of the EV marker, CD63, with colocalized EGFR by an operator/sample insensitive universal normalized calibration. We analysed untreated clinical samples of Glioblastoma to demonstrate this new platform. Notably, we target both total and “active” EGFR on EVs; with a monoclonal antibody mAb806 that recognizes a normally hidden epitope on overexpressed or mutant variant III EGFR. Analysis of samples yielded an area-under-the-curve (AUC) value of 0.99 and a low p-value of 0.000033, surpassing the performance of existing assays and markers.
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